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        視網(wǎng)膜上皮細胞;ARPE-19?實(shí)驗報告

        點(diǎn)擊次數:369 更新時(shí)間:2024-05-30

        視網(wǎng)膜上皮細胞;ARPE-19實(shí)驗報告:

        一、分離與培養:

        1、無(wú)菌條件下,取出1-3d 齡SD大鼠心房組織,然后用PBS將此組織塊清洗2次,將成1mm3左右大??;

        2、往組織塊中加入4 mL酶消化液(0.1% 和0.1% I型膠原酶),混懸10s,置37℃條件下消化10min,之后用滴管吹打制成單細胞懸液,自然沉淀并收集上清,用含10% FBS培養基終止消化后4℃放置;

        3、剩下的組織再加入3~4mL酶消化液,混懸10s,置37℃消化10 min后,按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置,重復此步驟2-3次,直至組織*被消化;

        4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細胞消化液,1200r/min 離心10min,棄去上清,沉淀細胞用含有10% FBS DMEM/F12培養基混懸,接種于25cm2培養瓶,放置于37℃ ,5%CO2 培養箱中培養;

        5、差速貼壁1h后,吸出培養基,按實(shí)驗需要接種于6孔板中繼續培養;

        二、免疫熒光鑒定:

        1、待心房肌細胞生長(cháng)至80%融合時(shí),棄去培養基,用溫育的PBS沖洗細胞2次,每次10min,然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min;

        2、PBS沖洗細胞2次,每次10min,然后在4℃條件下,用0.1%Triton X-100透膜15min;

        3、PBS沖洗細胞2次,每次10min,然后在室溫條件下,用4% BSA封閉細胞30min;

        4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗,然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過(guò)夜;

        5、PBS沖洗細胞3次,每次10min,按1:150的比例稀釋抗α-actin的二抗, 37℃條件下放置1h;

        6、用PBS沖洗3次,每次10min,在倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察圖像并拍照。


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